שיעור שביעי – רקומבינציה בפאג'ים:

 

ראשית, יש להבין את עיקרון מנגנון הרקומבינציה בפאג'ים בסדרת הניסויים הבאה: בפאג' T2 קיימת מוטציה בגן h אשר מאפשרת למוטנט זה לגדול על חיידקים בעלי עמידות לפאג'

h+( – אינו מסוגל לגדול על חיידקים עמידים; h– – מסוגל לגדול על חיידקים עמידים.)

 

הניסוי: נדביק חיידקים עמידים לפאג'ים (נכתב )TtoR בשני סוגי פאג'ים מוטנטים ,)h–( בMOI- גדול

.1-מ

 

 

התוצאות: כאשר בתוך התא החיידקי יש 2 גנומים משני

פאג'ים שונים – יכולה להתרחש רקומבינציה ביניהם. הסיכוי

לרקומבינציה – תלוי במרחק המפה בין שתי המוטציות. כאשר תתרחש רקומבינציה בין שני מוטנטים – תוצאות הרקומבינציה עשויות להיות מוטנט כפול, וכן WT נטול

ממוטציות.

נשאלת שאלה: כיצד ניתן לזהות רקומביננטים ולאמוד את

תדירותם?

 

 

נבדוק זאת על ידי השיטה הבאה:

–   נערבב פאג'ים מוטנטים שונים יחד עם חיידקי  TtoS בMOI>1- (על מנת לקבל רקומביננטים)

–   לאחר הפריצה, מערבבים את הפאג'ים שהתקבלו שוב עם חיידקי  ,TtoS אך הפעם ב-

MOI<1 (על מנת שנוכל לדעת שפלאק אחד מקורו בפאג' אחד)

–   לאחר הספיחה (לפני הפריצה) נוסיף חיידקי  TtoR ונזרע על הפלטה לקבלת פלאקים.

–   לפי מורפולוגיית הפלאקים, נדע להגיד האם מדובר במוטנט או רקומביננט:

• פלאק צלול, המשמעות היא שהתרחש ליזיס הן לחיידקיTtoS והן לTtoR , כלומר מדובר

במוטנט (טיפוס הורי  )h– .

• באם מתקבל פלאק עכור, המשמעות היא שהתרחש ליזיס רק עבור הרגישים לפאג,' ולכן

התקבל רקומביננט .)h+(

מרחק מפה בין שתי מוטציות מיוצג על ידי המשוואה הבאה:

כאשר אחוז הרקומביננטים – 100 ∗ ???????????????????????????? ????????????????????��

???????????????????? ????????????????????????????

 

אנו מכפילים ב2- מכיוון שכאשר מתרחשת רקומבינציה ומתקבל ,h+ בהכרח גם יתקבל h– בעל מוטציה כפולה, אך באמצעות המבחן הזה ניתן להבחין רק ברקומביננטים מסוג h+ , שכן

למוטנט כפול יהיה פנוטיפ זהה להורים.

 

 

באופן מדויק יותר, וכיוון שהסיכוי לרקומבינציה מושפע מעודף הDNA- הנגיפי בתא החיידק, מרחק

המפה d ניתן ע"י:                               כאשר P מייצג את הסתברות הרקומבינציה.

 

מכיוון ששיטה זו מתבססת על סריקה ולא סלקציה (כלומר, היכולת להבחין במס' הפלאקים והיחס ביניהם) שיטה זו מוגבלת ברזולוציה שניתן להבחין במרחק בין מוטציות, שכן יותר קשה להבחין

בפלאקים נפרדים, והחוקר מוגבל לשטח הפלטה.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ועכשיו לעיקר:

אלפרד הרשי מבודד מוטנטים רבים לאזור בגנום הנקרא rII המצוי בפאג'ים מסוג T2 וT4- ומראה

רקומבינציה במוטנטים אלו, אך הקהילה המדעית איננה משוכנעת כי אכן מדובר במוטציות שונות.

סימור בנזר ועבודתו על הregion- rII בפאג' :T4

בנזר לומד על מוטציה זו בפאג'ים, ובאופן מקרי מגלה תופעה ייחודית:

כתלות בזן הcoli– E. המודבק, מתקבלים פנוטיפים שונים: על

חיידקים מזן ,B כאמור,  מתקבלים פלאקים גדולים מהרגיל וטיטר נמוך. על חיידקים מזן K12 מתקבלים פלאקים בדומה ל,WT עם טיטר גבוה, ואילו על חיידקים

ליזוגניים מזן זה )K12(λ)( לא

מתקבלים פלאקים כלל!

 

 

 

בנזר מבין כי באמצעות פנוטיפים אלו ניתן לבנות מערכת מיפוי גנטי בעלת רזולוציה גבוהה מאוד:

 

–   זן B מהווה מאכסן אינדיקטיבי, כלומר לאחר ביצוע מוטגנזה לפאג'ים ניתן לזרוע, לזהות

ולבודד בקלות פאג'ים עם מוטציה ב.rII- –   K12 מאפשר לקחת מוטנטים מבודדים אלו ולגדל אותם על מנת לקבל תרחיף בעל טיטר

גבוה. –   K12(λ) מהווה מאכסן סלקטיבי כנגד פאג'ים מוטנטים לתכונה ,rII כלומר על זן זה ניתן

לבודד רקומביננטים rII+ נדירים לאחר הכלאה של שני זני rII- (בדומה לניסוי שראינו

בהתחלה!)

 

 

 

 

השיטה למיפוי זה בוצעה באופן הבא:

ראשית, בידוד:

.1  ביצוע מוטגנזה לפאג' .T4

.2  זריעה על זן B על מנת להבחין בקיומם של פלאקים גדולים.

.3  זיהוי פלאקים גדולים (מוטנטים ל)rII-

.4  הכנה של טיטר גבוה מן המוטנטים שהובחנו על ידי זריעה ב.K12-

לאחר מכן, מגיע שלב המיפוי:

.1  הדבקת זן K12 עם שני מוטנטים שונים לrII- ב.MOI>1-

.2 איסוף הצאצאים המתקבלים. .3  זריעת הצאצאים (אשר יתכן וחלקם רקומביננטים) בשתי צלחות בMOI<1- – זן K12 וזן

.K12(λ)

.4 ספירת פלאקים והשוואה.

באם מתקבלים פלאקים בK12(λ) , משמעות הדבר היא שהתחרשה רקומבינציה והתקבל רקומביננט ,rII+ ולכן ניתן לחשב את מרחק המפה המקורב על פי הנוסחה      כאשר אחוז הרקומביננטים מיוצג על ידי היחס בין הפלאקים שהתקבלו

בשתי הצלחות.

בנזר עושה עבודה נהדרת וחרוצה, ומצליח למפות מוטנטים רבים ברזולוציות מאוד גבוהות באזור ה-

.rII

דגש חשוב – מרחק מפה הינו מרחק הסתברותי, אינו אדטיבי ואינו מייצג מרחק פיזי בגנום. לדוגמה, אם מוטציה rII(1) נמצאת במרחק מפה 1.5 ממוטציה ,rII(2) ומוטציה rII(2) נמצאת במרחק 1.5

ממוטציה ,rII(3) אין זה אומר שהמרחק בין מוטציה 1 ומוטציה 3 הוא .3

המוטציות הקרובות ביותר אשר מצליח למפות נמצאות מרחק מפה של 0.02 זה מזה. אורך הגנום של הפאג' ביחידות מפה הוא ,1500 ואורכו בbp הוא .200,000 לכן, מס' הבסיסים המינימלי בין

מוטציות בו מצליח להבחין הוא:

^{200,000????????} ∗ 0.02???????? = 2.6????????

1500????????

 

כלומר המרחק המינימלי לרקומבינציה הוא 2.6 בסיסים, בהנחה של אקראיות (לכל הגנום סיכוי שווה

לעבור רקומבינציה.) באם אין אקראיות, ייתכן שהמרחק המינימלי קטן ומתקרב לבסיס .1

מוטציית חסר:

 

בהכלאות עבור חלק מן המוטציות, לא מתקבלים רקומביננטים, למשל:

ההסבר שמועלה עקב התופעה היא שבמוטנט A קיים חסר בגנום, החופף את האזור בו קיימת

מוטציה עבור זן B וזן ,C ולכן לא ניתן לבצע שחלוף.

תכונות נוספות אשר מתאפיינות בהן מוטציות חסר:

–   הקטנת מרחק המפה בין שתי מוטציות מהצדדים.

–    לא מתקבלים רברטנטים.