שיעור 13 – המשך אופרון הטריפטופאן בבצילוס סטיליס:

 

ינובסקי ממשיך לחקור את מהות הפעילות של הגן mtrB והחלבון אליו הוא מקודד.

הוא מבודד מוטנטים עמידים לMtr (ביטוי קונסטיטוטיבי) וכולם מתמפים לגן .mtrB ינובסקי בודק יחסי דומיננטיות רצסיביות אל מול הWT- בכל אחת מהמוטציות (כאמור, על ידי החדרת פלסמיד המכיל את המוטציה ל.)WT מגלה כי מרבית המוטציות רצסיביות אל מול ה,WT כלומר סביר שמדובר במוטציות

.of function

 

אך חלק מן המוטציות דווקא היו דומיננטיות על ה!WT מסקנתו של ינובסקי הייתה שהחלבון יוצר אוליגומר

=(חלבון אשר המבנה הרביעוני שלו הוא כמה חלבונים.)

מה הקשר בין דומיננטיות למסקנה?

ינובסקי מסיק שבמוטנטים אלו יש יצירה של חלבון פגום אשר מסוגל להתחבר לחלבונים אחרים, אך ברגע שמתחבר לכדי יצירת קומפלקס מפסיק את פעילותו. הוא מסיק שאם היה מדובר בדימר, הסיכוי ליצירת דימר WT היה גבוה יחסית ולכן היה ניתן להבחין בפעילותו, אך מכיוון שאנו מבחינים ביחסי דומיננטיות מובהקים

מצד מוטנטים אלו הוא הסיק שמדובר באוליגומר, אשר הסיכוי ליצירתו מחלבוני WT בלבד נמוך ביותר.

המוטנטים הרצסיביים ככל הנראה, נובעים בתוצאה ממוטציית ,non-sense מוטציה שלא יכולה לעבור

אוליגומריזציה או כזו שלא מפסיקה את הפעילות של האוליגומר אליו היא מחוברת.

לאחר גיבוש קריסטלוגרפי מתברר כי אכן מדובר באוליגומר אשר מורכב מ11 תתי יחידות. כל תת יחידה קושרת ,W כך שכל אוליגומר קושר 11 מולקולות .W בעת שקשור האוליגומר ל,W- יכול

לקשור את מקטע הרנ"א של הלידר, ברצף החוזר אשר

נצפה בניסוי הפלסמידים.

בתמונה זו (גיבוש אמיתי) ניתן לראות את האוליגומר (באפור) קושר W (ארגמן,) ומוקף במקטע רנ"א

סינתטי (מקטעים אדומים,GAG- כחולים )AU

 

 

 

 

 

 

 

כמוזכר, המקטע המקורי אשר מצאו בלידר מעט שונה מן המקטע המסונתז, שכן קיימים צירופים שונים של NAG והמרווח לא תמיד שני נוקלאוטידים ולעיתים שלושה. עוד נמצא כי קיימת היררכיית אפיניות לפי סוג

המקטע ולפי סוג הרצף, כאשר עוצמות הרצפים הם לפי הסדר הבא: וכן כי ההפרש האופטימלי בין כל רצף הוא שני נוקלאוטידים עבור

קישור מקסימלי. משמעות הדבר היא, שהרצף המקורי הנמצא בלידר אינו אידיאלי לקשירה מקסימלית, ויש

בכך משום יתרון אבולוציוני – האפיניות היא בדיוק בעוצמה הנכונה בשביל תפקוד תקין של הלידר.

לאוליגומר זה ניתן השם .TRAP על פי המודל המוצע אם כך, התוצאות מוסברות: בנוכחות ,W נקשר TRAP

לרנ"א של הלידר ומונע יצירת לולאת אנטי-טרמינציה לכדי טרמינציה של שעתוק; בהעדר ,W לא נקשר,

נוצרת לולאת אנטי-טרמינציה – המשך האופרון.

עוד נמצא כי TRAP מונע את תרגום האופרון, בכך שרצף הdelgarno- shine (רצף המסמל תחילת תרגום)

נמצא בטרמינטור, לכן בעת קישור TRAP יש גם מניעה של התרגום.

 

אם כך, נהדר, הכל מוסבר. אבל ממצא אחד עדיין לא מתיישב עם מודל :TRAP

מחקר אשר פורסם ודיווח על ביטוי מוגבר של אופרון הW- במוטנט ts (רגיש לטמפרטורה) אשר פגוע ב-

.tryptophanyl-tRNATrp synthetase

איך זה בא לידי ביטוי? ב42 מעלות, פעילות האנזים נמוכה מאוד ובטמפ' זו יש ביטוי מוגבר של אופרון הW-

גם בנוכחות .W כאמור, תפקיד הsynthetase- הוא לצמד בין חומצה אמינית לבין הtRNA- המתאים לה,

כלומר שאם פעילותו נמוכה, ימצא הרבה tRNA אשר אינו טעון בחומצה אמינית.

משמעות הדברים אם כך, שהאופרון מגיב לנוכחות של tRNA של W אשר אינו טעון!

אך כיצד? אין במודל הבקרה של TRAP שום אזכור לכך, האם ישנו מנגנון נוסף או שיש ביניהם קשר?

ראשית ניתן לבחון האם יש ביניהם קשר באופן הבא:

אנו יודעים כי מוטציה בTRAP תביא לעליה בביטוי האופרון, שכן אין קישור לmRNA של הלידר; עוד אנחנו יודעים שהמוטציה הרגישה לחום גם היא מביאה לעליה בביטוי האופרון ב42 מעלות. באם מדובר במערכות נפרדות, מוטנט כפול אמור להפיק יותר W משתי המוטציות בנפרד. לעומת זאת, אם מוטציה אחת "תיבלע"

בתוך השניה, שתיהן שייכות לאותו מסלול וקיימים ביניהן יחסי אפיסטזיס.

ינובסקי מבצע את סדרת הניסויים הבאה:

 

 

וכעת נסביר:

ינובסקי מבקש לבדוק את השפעת נוכחות מוטציה אחת או שתיים, בנוכחות W או בהעדרו, ב42 מעלות או 32 מעלות. הבדיקה מבוצעת על ידי בדיקת פעילות של האנזים אנתרילין סינתאז, אשר הוא האנזים הראשון

באופרון ה.W-

שתי הבדיקות הראשונות, WT (ללא מוטציות) בנוכחות W או בהעדרו, יכולים לראות שהטמפ' פחות משפיעה

במקרה הזה, אך נוכחות הW- מביאה לירידה בפעילות, כמצופה;

שתי הבדיקות לאחר מכן, מבוצעות על מוטציית הts- לסינתטז, כאשר ניתן להבחין שהעדר W האופרון מתפקד תקין ב32 מעלות, אך בהעדר W ו42 מעלות – אין גדילה. הסיבה לכך היא כאמור, חוסר בW- הוא

לתאלי. אך, בנוכחות W ב32 מעלות אנחנו רואים פעילות קטנה של האופרון כמו ב,WT- אך ב42 מעלות –

עלייה משמעותית בפעילות האופרון.

שתי הבדיקות לאחר מכן בודקות מוטציה לTRAP בלבד, ניתן לראות שאין השפעה לנוכחות הW- או להעדרו, וכי ישנה השפעה מסוימת לטמפ' שככל הנראה קשורה לתפקוד המטבולי של האנזים בסביבה החמה. נשאלת מכאן שאלה – מדוע אנו רואים עליה כה משמעותית בהעדר ?TRAP מדוע איננו רואים רמת פעילות דומה

לWT בהעדר ?W הרי בשני המקרים (אין W או שTRAP- איננו קיים) אנחנו מניחים שTRAP אינו נקשר! הסיבה היא שTRAP נקשר גם ללא נוכחות ,W נקשר באפיניות נמוכה יותר, אך עדיין נקשר ומביא

לטרמינציה; מצב זה שונה מחסר מוחלט בו (דגש: TRAP הינו חלבון אלוסטרי.)

 

והמבחן האמיתי – מוטנט כפול. ניתן לראות שגם במקרה הזה אין משמעות לנוכחות של ,W אך יתרה מכך –

רמת הפעילות המובחנת דומה לפעילות של מוטנט יחיד ב!TRAP-

משמעות הדבר היא שחישת tRNA לא טעון נעשית באותו מסלול כמו ,TRAP וכי קיימים ביניהם יחסי

אפיסטזיס.

דגש חשוב: בעמודה האחרונה יש מבחן בדיקה דומה גם על בסיס רמת ביטוי של β-gal ולא רק אנתרילין

סינתאז, אך התוצאות שהתקבלו בעייתיות כי הטמפ' הגבוהה משבשת את הפעילות בassay- זה.

 

 

 

תוכן עניינים

בלוג
פינוי מדירה – אין צורך בידע מוקדם

חתימה על חוזים מסוימים, למשל, חוזה שכירות, היא פעולה שגרתית יומיומית. זו אינה מצריכה ידע מוקדם מן הצדדים ופעמים רבות, החוזה הוא במתכונת סטנדרטית. הדבר

הניסוי:

  ג'קוב מעלה את הטמפ' ומחזיר אותה למצב הקודם – נראה כי החיידק כבר לא מחוסן בפני פאג'ים אחרים. האם עבר ?curing התשובה היא לא,

שיעור 12 – אופרון הטריפטופאן:

      עיקר השיעור הוא על מנגנון האופרון בsubtilis– ,B. אך ראשית עלינו להבין את המנגנון המתרחש בcoli– E. (חלק מן המידע מתוך מיקרוביולוגיה:)

בלוג
פינוי מדירה – אין צורך בידע מוקדם

חתימה על חוזים מסוימים, למשל, חוזה שכירות, היא פעולה שגרתית יומיומית. זו אינה מצריכה ידע מוקדם מן הצדדים ופעמים רבות, החוזה הוא במתכונת סטנדרטית. הדבר

הניסוי:

  ג'קוב מעלה את הטמפ' ומחזיר אותה למצב הקודם – נראה כי החיידק כבר לא מחוסן בפני פאג'ים אחרים. האם עבר ?curing התשובה היא לא,

שיעור 12 – אופרון הטריפטופאן:

      עיקר השיעור הוא על מנגנון האופרון בsubtilis– ,B. אך ראשית עלינו להבין את המנגנון המתרחש בcoli– E. (חלק מן המידע מתוך מיקרוביולוגיה:)