כיצד התגלו הגנים באופרון הלקטוז, וכיצד נקבע מיקומם?
הגנים באופרון הינם גן –lacZ האחראי
לסינתזת האנזים ,β-galactosidase
lazY האחראי ליצירת permease אשר
היא משאבה המכניסה לקטוז לתוך התא,
transacetylaseל מקודד אשר lacA-ו
אשר מבצע אצטילציה ללקטוז. בנוסף הגן I – גן אשר מוביל לאינדוקציה (אשר לימים
יתברר כגן המקודד לרפרסור.)
1947 – לדרברג מבודד מס' מוטנטים של coli E. אשר הם אינם מסוגלים לנצל לקטוז כמקור פחמן,
חלקם פגועים באנזים β-galactosidase ומכונים .z-
בנוסף, מבודד גם מוטנט אשר אינו עובר אינדוקציה בהוספת לקטוז – כלומר מוטנט אשר מסנתז β-
galactosidase גם ללא נוכחות לקטוז, ומכנה את הפנוטיפ קונסטיטוטיבי (מתמשך.)
כל המוטנטים הראו תדירות רקומבינציה נמוכה מאוד – כלומר, הגנים הללו סמוכים מאוד זה לזה linked( .)tightly את המיפוי הם עשו על ידי שימוש בטרנסדוקציה, והניחו שהגנים נמצאים ממש
אחד אחרי השני.
הנחה של מונו: לאחר תוספת משרן, ריכוזו בתא שווה לריכוזו במצע הגידול.
מחליט לבדוק זאת על ידי שימוש בTMG- רדיואקטיבי TMG( התגלה כמשרן אשר אינו מעכב) כדי למדוד את הריכוז התוך תאי. מגלה שבריכוזי משרן נמוכים מאוד, הריכוז בתא גבוה פי 100 מהריכוז
במצע. משמעות הדבר היא שישנה הובלה אקטיבית של המשרן כנגד מפל הריכוזים מהחוץ פנימה.
עוד מגלה שקיימים מוטנטים אשר אינם מסוגלים לנצל לקטוז כמקור פחמן ,)lac–( אך בעלי β- galactosidase תקין (ניתן לגלות זאת על ידי מבחן האינדוקציה מן הפרק הקודם) – המוטציה גורמת לכך שהחיידק אינו חדיר ללקטוז. על ידי מבחנים ביוכימיים (מיכאליס מנטן, בדיקת השפעה
טמפרטורה) הוכיח מונו שעל הכנסת הלקטוז אחראי אנזים, ומכנה אותו .permease
עוד ממשיך ומגלה מונו כאשר משתמש בIPTG רדיואקטיבי (משרן נוסף שאינו מעכב) שחלק ממנו עובר אצטילציה. האצטילציה מתרחשת רק כאשר מתרחשת אינדוקציה או בחיידקים בעלי פנוטיפ קונסטיטוטיבי, ולכן מסיק שמדובר באנזים נוסף אשר מבצע זאת. אכן לאחר בדיקות מגלה שמדובר באנזים אותו הוא מכנה ,transacetylase אשר נמצא בתאחיזה חזקה לשאר הגנים באופרון. תפקיד
האנזים לא ברור עד היום.
וכעת חזרה לשאלה המקורית – מה קורה כמתרחשת אינדוקציה? מהי machinery" ?"inducing
ג'קוב, כמומחה לליזוגניות וקוניוגציה ובידוד מוטנטים, מקבל הצעה ממונו לשיתוף פעולה בחקר
מערכת הלקטוז, והשניים חוברים יחד למחקר.
1957 – מארח מונו פיזיקאי בשם ליאו זילרד ומספר לו על הממצאים שלו עד כה בנוגע למחקר על פירוק הלקטוז. ליזרד מסיק שמדובר בבקרה שלילית, כלומר משהו במערכת מונע סינתזה של הגנים
במערכת פירוק הלקטוז, וכי האינדוקציה למעשה מסירה את הדבר אשר מונע את הסינתזה.
מונו מתרשם מהנאמר, וטוען שאם כך הדבר – WT בעל גן I מתפקד יהיה דומיננטי על מוטנט לגן I
(קונסטיטוטיבי.) פירוש הדברים מופיע בתרשים הבא:
*ההסבר הסביר יותר הוא בקרה השלילית, מכיוון שהיפותזת הבקרה החיובית מניחה מוטצית gain
functions of – שהן נדירות יותר.
ג'קוב ומונו חוברים למדען נוסף בשם פארדי, ומחליטים לבחון יחסי דומיננטיות רצסיביות כאשר משתמשים בקוניוגציה ככלי המחקר, ובשימוש של זן Hfr אשר מעביר את lacZ בשלב מוקדם
וביעילות גבוהה.
אז כיצד ניתן לבחון יחסי דומיננטיות-רצסיביות בחיידקים אשר הינם יצורים הפלואידים (בעלי עותק
אחד של הגנום?)
סכימת ניסוי:
.1 מכליאים בין זן הHfr- אשר הוא I+Z+ ורגיש לסטרפטומיצין עם זן מקבל F-I-Z- עמיד
לסטרפטומיצין.
.2 מפסיקים את הקוניוגציה לאחר זמן מה ומוסיפים סטרפטומיצין על מנת להרוג את
התורם.
.3 מודדים את הפעילות של β- galactosidase בנקודות זמן שונות תוך
שימוש ב ,ONPG כאשר בודקים האם יש פעילות עם או ללא אינדוקציה (שימוש
.)IPTGב
המטרה היא לצפות האם המקבל כעת רגיש
לאינדוקציה =(אינדוסיבילי) או לא.
למה שהניסוי הזה יאפשר לנו לראות יחסי
דומיננטיות רצסיביות?
מכיוון שהיה ידוע מניסויים קודמים, שהדנ"א המועבר בקוניוגציה אינו חייב לבצע רקומבינציה עם הזן המקבל על מנת שנוכל לראות פעילות, כלומר
הוא יכול להתקיים בציטופלסמה ולהתבטא – על ידי כך מתקבל merozygot transient – חיידק
בעל שני עותקים של גנים מסוימים =(דיפלואיד חלקי.)
1959 השלושה מוציאים מאמר המסכם את הממצאים שלהם, מכונה PaJaMo (קיצור השמות של
החוקרים.)
מונו לפני הניסוי, מאמין כי דווקא היפותזת הבקרה החיובית היא הנכונה, וחושב שהגן I אחראי לסינתזה של inducer internal
אשר מביא לסינתזה של .β-gal
ג'קוב דווקא האמין כי ההפך הוא הנכון, ושואב השראה מן הממצאים שלו בניסויי ה- zygotic ,induction בהם נראה שכאשר תורם ליזוגני מעביר את המקטע המכיל את הגנום הפאג'י למקבל לא ליזוגני – מתרחשת אינדוקציה. עוד אז, סברו כי יתכן שפקטור ציטופלסמטי אצל התורם מונע אינדוקציה, או לחלופין פקטור אצל המקבל מעודד אינדוקציה, כאשר ההסבר הראשון נשמע סביר יותר. לפיכך, מניח כי גם כאן מדובר במעכב אשר מונע סינתזה של ,β-gal ובעת השריית אינדקוציה
מאפשר סינתזה.
כעת, ניתן לדבר על הניסוי, מה בוצע ומה התגלה.
ראשית, יש לבצע ביקורת למערכת:
ידועים 3 גנים אשר מוטציה בהם גורמת לפנוטיפ שונה מה:WT-
- מוטציה בגן lacZ תוביל לכך שהמוטנט לא יהיה מסוגל לפרק לקטוז, ולכן לא נראה
פעילות.
- מוטציה בגן lacY תוביל לכך שהחיידק לא יהיה מסוגל להכניס לקטוז לתאים – לא נראה
פעילות פירוק לקטוז בחיידק
- מוטציה בגן lacI תוביל לכך שלא יהיה ניתן לבצע אינדוקציה, והפנוטיפ שנקבל הוא
קונסטיטוטיבי.
ראשית מבצעים הכלאת ביקורת כפי המוצג, בין תורם WT רגיש לסטרפטומיצין, ומקבל מוטנט Z-
עמיד לסטרפטומיצין. הכלאה זו בוצעה בדומה לסכמה המוצגת למעלה של הניסוי – נותנים לקוניוגציה להתרחש ולאחר זמן מה הורגים את התורם על ידי סטרפטומיצין, ומשרים IPTG לבחון
פעילות אינדוקציה.
מה נותנת הכלאה זו? רוצים לבדוק שאכן המערכת עובדת. כלומר, אם מתקבל מרוזיגוט אשר יהיה בעל גן Z תקין, הוא יהיה בעל
פנוטיפ של ,WT אינדוסבילי (מגיב למשרן) ומסוגל לפרק לקטוז. אכן מתוצאות הניסוי ניתן לראות שכך הדבר ובאמת החיידק המקבל כעת יכול לסנתז .β-gal בנוסף, רוצים לבדוק יצירה של רקומביננטים (תזכורת – הם
מעוניינים בקבלת מרוזיגוטים ולא רקומביננטים) ואכן נמצא שמתרחשת רקומבינציה, אך היא מופיעה בכמות זניחה
ביחס למרוזיגוטים.
בנוסף, בודקים השפעה של הקרנת המקבל בUV כדי לראות האם אכן הפעילות המובחנת של β-gal היא מן המקבל, ואכן בהריגת המקבל לא
מתקבלת פעילות.
וכעת הניסוי המרכזי:
מבצעים הכלאה בין תורם ,WT אשר הוא רגיש הן לסטרפטומיצין והן לפאג' T6 (מאפשר להרוג את התורם ביעילות גבוהה יותר) יחד עם מוטנט לגן Z-I- אשר עמיד לאנטיביוטיקה ולפאג.' כעת נבחן את
התוצאות:
ראשית מוסיפים לאחר זמן מה T6 וסטרפ והורגים את התורם. זמן קצר לאחר מכן
מודדים פעילות של β-gal עם ובלי משרן. מהתוצאות ניתן לראות שהוספת המשרן
גורמת לעלייה דרמטית בפעילות האנזים,
לעומת כאשר לא מוסף המשרן. מסקנה מכאן – I+ אכן דומיננטי על !I-
ונשאלת בכל זאת שאלה מהתוצאות – מדוע אנו רואים פעילות בהתחלה? מדוע כאשר לא מוסיפים משרן ישנה פעילות בפלטו? הסיבה לכך נובעת מזמן הייצור של הרפרסור – Z+ נכנס לתא ומתחיל לסנתז .β-gal בנוסף נכנס גם I+ ומתחיל לסנתז רפרסור, אך זה לוקח זמן. בזמן עד לסינתוזו אנו
יכולים להבחין בפעילות של אנזימטית.
כעת מתקבלת ההנחה של בקרה שלילית, ומועלות שתי הצעות לטבעה:
