עיקר השיעור הוא על מנגנון האופרון בsubtilis– ,B. אך ראשית עלינו להבין את המנגנון המתרחש
בcoli– E. (חלק מן המידע מתוך מיקרוביולוגיה:)
ראשית, כרמת בקרה ראשונה קיים רפרסור אשר פעיל רק בנוכחות
טריפטופאן (הטריפטופאן מכונה במקרה זה )co-repressor אשר מונע שעתוק גנים האחראים לסנתוז .W ההיגיון מאחורי זה ברור, שכן אם יש עודף בW
אין צורך לסנתזו W( – טריפטופאן) מכיוון שסינתזה עולה אנרגיה. מוטנטים שבודדו על ידי ג'קוב וחברו אשר ביטאו W באופן קונסטיטוטיבי הביאו לגילוי הגן trpR וכן
את הרפרסור המקודד ממנו, .TrpR אך,
גם מוטנטים אלו הגיבו לנוכחות ,W אם כי במידה פחותה.
1972 – ברוס איימס, מדען נחשב, מפרסם תגליות שלו כי הרפרסיה באופרון ההיסטידין משופעלת
על ידי ,tRNAHis ולא על ידי ההיסטידין עצמו.
צ'ארלס ינובסקי חוקר את אופרון הW- בcoli– .E. מגלה שחסרים במקטע DNA אשר נמצא בין האופרטור לגן המקודד הראשון באופרון אך לא כללו חלקים מהפרומוטור ומהאופרטור, גרמו לעליה של פי 4 לעד פי 8 בביטוי
האופרון. אזור החסר נקרא region leader והתגלה שהוא
משועתק ל.mRNA-
השערה: אזור זה אחראי על הפסקת השעתוק, ולכן
החסרתו מובילה לעליה בביטוי השעתוק.
השערה זו התבססה גם על ידע מוקדם שכאשר מוסיפים W למצע חיידקים כאשר אין חומצה זו,
מובחנת טרמינציה מוקדמת של שעתוק האופרון, כאשר השעתוק מסתיים במקטע ה.leader
אטנואציה =(החלשה) כרמת בקרה
שניה:
ראשית יש להבין שבחיידקים, בניגוד
לאאוקריוטים, שעתוק מצומד לתרגום, כלומר טרם שpolymerase- RNA סיים לשעתק את כל הגן כבר מגיע
הריבוזום ומתחיל לתרגם אותו.
מעבדתו של ינובסקי מגלה שאורך הleader הוא כ240- בסיסים וקובעים את הרצף שלו. מאנליזה של הרצף הועלתה ההשערה, שהleader- מסוגל ליצור מבנים שניוניים
אלטרנטיביים, בין היתר מבנים המזכירים טרמינטורים של שעתוק. מובחנים 4 אזורים, הממוספרים 1 עד ,4 כאשר מן האנליזות נראה כי מקטע 1 יכול להקשר למקטע ,2 מקטע 2
יכול להקשר למקטע ,3 ומקטע 3 יכול להקשר למקטע .4 באם מקטע 1 נקשר למקטע 2 – לא יהיה פנוי מקטע 2 להקשר למקטע 3 ולכן יווצר קשר בין 3 ל4- (חיבור מקטעים
אלו נקרא גם .)attenuator
כמו כן, מאנליזה של הרצף מזוהה מסגרת קריאה (קודון AUG בתחילה, שלישיות קודונים ובסוף
קודון סיום) באורך 14 חומצות אמינו כאשר באמצע שני קודונים המקודדים ל.W-
מדוע זה משנה? בקרוב יתבהר כי נוכחותם מהותיים לבקרה. טרם התגלית היה ידוע שמוטנטים הפגועים
בsynthetase- לW- או לחילופין ב- tRNATRP (לא לגמרי, אחרת זה
לתאלי) זוהו כבעלי תדירות נמוכה של טרמינציית שעתוק באזור ה.leader-
בנוסף, זוהה כי מצב זה, של המצאות רצף leader המכיל מסגרת קריאה בעלת חומצות האמינו מהאופרון שבא אחריהם חוזר במקרים
נוספים.
לכן הועלתה השערה שהמנגנון עובד באופן כזה, שריכוז החומצה האמינית של האופרון
בציטופלסמה משפיע באופן מסוים על תהליך השעתוק דרך קודונים אלו.
אכן כך התגלה, והמנגנון עובד באופן הבא:
polymerase RNA נקשר לפרומוטור ומתחיל שעתוק לפני אזור ה,leader- ומעט לאחר מכן מגיע הריבוזום מתחיל לבצע
תרגום תוך כדי שממשיך השעתוק. באם אין ,W כאשר יגיע הריבוזום לקודוני הW- הוא ישתהה. השתהותו מונעת את קישור מקטע 1 למקטע ,2 מה שמאפשר ליצירת קשר בין מקטע 2 עם מקטע .3 מקטע 3 כעת לא פנוי להקשר עם מקטע 4 (מקטע 3 ו4- יוצרים לולאת טרמינציה לשעתוק) והשעתוק של
האופרון ממשיך כסדרו, על מנת לסנתז .W
באם קיים ,W הריבוזום אינו משתהה, ולכן נוצר קשר בין מקטע 3 ל,4 מה שמביא להפסקת השעתוק (מבנה זה של טרמינטור
מכונה גם .)hairpin
עד כה, אופרון הטריפטופאן באי קולי – וכעת האופרון בsubtilis– :B.
ינובסקי חוקר גם את הבקרה על סינתזת W בsubtilis- B. (די רחוק מאי קולי, שכן הוא גראם חיובי לעומת אי קולי אשר הוא גראם שלילי,) ומוצא שגם באופרון זה קיים מקטע לידר (כלומר, מקטע דנ"א המקדים
לפרומוטור ולאופרטור אשר משועתק לרנ"א,) אך הרצף שלו שונה לחלוטין משל coli ,E. ויותר מזה – כלל
אינו מכיל מסגרת קריאה!
כלי המחקר: היה ידוע שחיידקים אשר מבטאים W בכמות גדולה או מקבלים W ממקור חיצוני יכולים לגדול בנוכחות אנלוג
של ,W ,5-methyltryptophan מכיוון שככל הנראה האפיניות לW- גבוהה יותר מאשר האפיניות לאנאלוג.
אנלוג זה אם כך, רעיל לחיידק, משתי סיבות:
- עובר גם הוא אינקורפרציה לחלבון בתהליך התרגום.
- מביא לרפרסיה באופרון הW- על ידי קישור לרפרסור ודיכוי סינתזה של .W
לכן, מוטנטים אשר מייצרים W באופן קונסטיטוטיבי – אינם רגישים לאנלוג ויכולים לשרוד בנוכחותו (ולעומתם
חיידקי WT ללא W אינם גדלים ומתים.)
מערכת זו למעשה מאפשרת להבדיל בין ביטוי אינדוסבילי של האופרון, או ביטוי קונסטיטוטיבי, וכעת ניתן
לבחון סיטואציות שונות:
בכדי להבין מה קורה כאשר ישנו עודף במקטע
הלידר, הוחדרו פלסמידים לקבוצות חיידקים שונות, כאשר בכל פעם אורך הפלסמיד התקצר ונבדקה הרגישות ל.Mtr- נמצא כי כאשר אורך המקטע התקצר לכדי 66 זוגות בסיסים (אורך הלידר
המקורי הוא )319 הובחנה רגישות מסוימת ל,Mtr- וכי פחות מזה – חיידקים רגישים לMtr ומתים בנוכחותו (כלומר, ביטוי אינדוסבילי ולא
קונסטיטוטיבי.) מסקנה אפשרית מכאן היא שהרצף אשר מקנה עמידות לMtr- נמצא במקטעים
שהוסרו, וספציפית מקטע אשר הוסר במעבר בין
ptrpdH4 (מוקף באדום) לבין .ptrpdH5
אכן מובחן שבמקטע המוסר, ישנם חזרות של שלישיית הנוקלאוטידים NAG N( מציין שיכול להיות כל נוקלאוטיד,) כאשר בין כל שלשה מפרידים 2 או 3 בסיסים. משמעות רצף זה
תתברר בהמשך.
אנליזות מבנה שונות אשר היו זמינות באותה התקופה אפשרו לחזות 2 מבנים אפשריים אשר יכולים להיווצר במקטע הלידר, כאשר
הלידר חולק ל4 סגמנטים אשר מוספרו :A-D יצירת חיבור בין מקטע C למקטע D יצרה מבנה המזכיר לולאת טרמינציה אשר מביאה לסיום שעתוק, ואילו יצירת חיבור בין מקטע A
וB- יצר לולאה אשר כונתה "אנטי-טרמינציה,"
אשר תביא להמשך שעתוק.
