בנזר ממשיך בעבודתו הטובה, ואף משכלל את מערכת הניסוי על ידי הבנה של הפוטנציאל הטמון
במוטציות החסר.
הבעיה: בנזר מעוניין לקחת מוטציות חדשות שבודד, או שבודדו על ידי חוקרים אחרים ולמפות אותו באופן מדויק בגנום. בתחילה חושב על שימוש בתאחיזות ורקומביננטים באמצעות מוטנטים שלו שכבר בידד ומיפה, אבל מבין ששיטה זו תהיה בעייתית יותר שכן הוא אינו יודע איזו מוטציה ידועה
שלו נמצאת בסמיכות למוטציה החדשה אותה רוצה למפות.
הפתרון: שימוש במוטציות חסר:בנזר מחלק את ה- rII ל7 סגמנטים שונים, ומכליא את המוטנט החדש אותו רוצה למפות עם מוטנטים בעלי חסר
בסגמנטים אלו, ומחפש רקומביננטים. ההגיון מאחורי אופן פעולה זה, שהיכן שלא תתרחש רקומבינציה – המשמעות היא שהמוטציה של
המוטנט החדש נמצאת שם. לאחר שמוצא באיזה סגמנט מצויה המוטציה, מחלק אותו ל4- תת סגמנטים ומבצע בדיקה דומה שוב, מאתר באיזה סגמנט נמצא החסר, מחלק את אותו הסגמנט שוב לכמה חלקים וכך הלאה, עד אשר מצליח להגיע
למיפוי המוטציה ברזולוציה גבוהה ביותר.
*מקרא התמונה – האזורים המסומנים בורוד כהה
מייצגים חסרים וורוד בהיר מקטעים קיימים.
בנזר באמצעות שיטות המיפוי שלו מצליח לזהות כי ישנם אזורים בגנום אשר אינם בעלי מוטציות בכלל או כמעט בכלל, ולעומת זאת ישנם אזורים אשר בהם מתרכזות מוטציות רבות, והוא מכנה
אזורים אלו spots .hot
וכעת בנזר שואל שאלה – האם rII מורכב מכמה גנים? אם כן, מכמה? כיצד ניתן לבחון זאת?
ניתן לבחון שאלות אלו על ידי מבחני קומפלימנטציה – נזרע שני פאג'ים בעלי מוטציות שונות בrII- על מצע של .K12(λ) באם המוטציה קיימת לשניהם באותו הגן, לא נצפה לקבל פלאקים שכן הם לא יוכלו לספק זה לזה את החלבון החסר. אך באם לאחד מוטציה בגן מסוים, ולאחר בגן השני – כל
אחד מהם יסנתז את החלבון החסר לאחר, תהיה קומפלימנטציה ונוכל להבחין בפלאקים.
אך ראשית יש לבחון האם המוטציה בrII- היא דומיננטית או רצסיבית – שכן באם היא דומיננטית גם אם נכליא אותה עם WT תקין לכלל הגנים היא תדכא את הפנוטיפ שלו ולא יתקבלו פלאקים. מכך, את מבחן הדומיננטיות
אכן מבצעים על ידי הכלאה של המוטנטים עם WT ב- ,MOI>1 כאשר אם לא יתקבלו פלאקים מדובר במוטציה דומיננטית ואילו קבלת פלאקים תעיד על מוטציה
רצסיבית.
תוצאות הניסוי הראו כי כל המוטציות הינן רצסיביות.
loss
– מוטציות של
תוצאות אלו מדגימות עיקרון חשוב
function ,of כלומר מוטציות אשר גורמות לכך שהחלבון
לא יתפקד הן בדר"כ רצסיביות.
לאחר מכן, ניתן היה לבצע את מבחני הקומפלימנטציה. מדביקים K12(λ) עם שני מוטנטים לrII- בMOI>1- ובוחנים התפתחות של פלאקים. מכיוון שבנזר בנה מפה מדויקת וידע להציב היכן נמצאת כל מוטציה, יכל לבצע ניסוי זה מס' פעמים ממוטציות שונות כאשר הוא משנה
את המרחקים בין מוטציות כל הזמן.
לאחר כמה חזרות, מבדיל בין שני אזורים להם הוא קורא A ו,B- ונותן להם את הכינוי ציסטרונים – מקטעים בדנ"א החייבים להיות שלמים בcis- כדי ליצור פנוטיפ
WT (הידועים כיום בגנים.)
הקוד הגנטי:
1961 – קריק וחוקרים אחרים מוציאים מאמר בו הם דנים על מה שידוע לגבי הקונספט של הקוד הגנטי. עדויות שונות מראות כי קיים קשר בין רצף הנוקלאוטידים בדנ"א לרצף חומצות האמינו
בחלבון.
להנחה זו קיימות שאלות רבות, למשל, האם הקוד הגנטי נקרא כאשר
יש חפיפה בין נוקלאוטידים, או לא?
באם נניח שישנה חפיפה בין הנוקלאוטידים, משמעות הדבר היא שמוטציה נקודתית בנוקלאוטיד
אחד אמורה להשפיע על שתי חומצות אמינו, אך עדויות שונות הוכיחו שאין זה כך.
האם כל זוג נוקלאוטידים מקודד לחומצה אמינית? כל שלשה? כל רביעייה? – לא ניתן לומר בודאות, אך סביר כי מדובר על שלשות לכל הפחות, שכן יכולים להתקבל רק 16 צירופים שונים משני
נוקלאוטידים, ואין זה מסתדר עם העובדה שקיימות 20 חומצות אמינו ידועות. מצד שני, קיום של
שלשות אומר כי ישנם 64 צירופים שונים, וזה הרבה מעבר למה שנדרש.
כיצד יודע החיידק היכן להתחיל לתרגם? האם יש שלשות אשר מביאות לקידוד )sense( בעוד שאחרות מביעות משהו אחר שאינו קידוד ?)nonsense( האם ישנם "סימני פיסוק" בתהליך הקריאה, למשל, כל בסיס רביעי הוא מעין "פסיק" או משהו כזה? במילים אחרות, האם מסגרת
הקריאה הינה רציפה או בעלת ניקוד?
עבור שאלת מסגרת הקריאה, נבחר הrII- כמודל לחקר שאלה זו:
הסיבה לשימוש בחומר זה היא שרצו לבחון האם הוספה או החסרה של בסיס תגרום לשינוי בתפקוד, או במילים אחרות – אם מסגרת הקריאה רציפה וללא פיסוק, הוספה או החסרה תוביל
לשינוי הפעילות.
אופן הניסוי התנהל באופן הבא:
מוטגנזה ובידוד :rII
– מדביקים חיידקי K12 בפאג' T4 בנוכחות yellow .acridine
– אוספים את הצאצאים לאחר התפרצות
– מדביקים זן B ומחפשים פלאקים גדולים .)rII-(
בידוד "רברטנטים:"
– נדביק חיידקי K12 עם המוטנטים ל,rII שוב בנוכחות עם yellow .acridine
– אוספים את הצאצאים לאחר ההתפרצות.
– מדביקים K12(λ) ובודקים יצירה של פלאקים (פנוטיפ )WT
לאחר הכלאות, מבינים כי אין מדובר ברברטנטים, כי אם בסופרסיות.
בתמונה ניתן לראות את אחת המוטציות עם הסופרסורים שלה (המוטציה המקורית מסומנת כ,FC0-
וכל שאר הסימונים הם סופרסורים שכאשר היו נוכחים, הובחן פנוטיפ .)WT
לאחר שהתברר כי מוטציה נוספת היא זו שהביאה לסופרסיה, עוד התגלה כי אותה מוטציה המביאה לסופרסיה כאשר מצויה היא בלבד, מובילה לפנוטיפ של rII (במילים אחרות, המוטציה המקורית
סופרסורית אליה.)
לאחר מכן, מבודדים קריק ועמיתיו מוטציות סופרסיות לסופרסיות שנמצאו (אין הכוונה כאן לסופרסיה אשר מבטלת את פעילות הסופרסיה הראשונה ומחזירה לפנוטיפ ,rII אלא פשוט סופרסיה שכאשר
היא והסופרסיה הראשונה מצויות יחד, מתקבל פנוטיפ .)WT
גם הסופרסיות לסופרסיות – מתגלות כמוטציות אשר מביאות לפנוטיפ rII כאשר לבדן.
